CRISPR-Cas9应用——基因敲除与敲入系统
1、这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。
2、CRISPRCas9系统最初在细菌和古细菌中被发现，是一种细菌应对外来病毒或质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。当外源DNA首次侵入细菌时，外源DNA被Cas核酸酶切割，并以间隔序列形式整合到CRISPR基因座中。
3、CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
4、从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。
稳定株筛选时为什么加嘌呤霉素细胞就漂
1、可以不加嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始，有时候加嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始了会有拮抗作用。1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始的密度铺板嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
2、G418(一)确定最优筛选浓度由于每种细胞对含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
3、中文名为嘌呤霉素，常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等 *** 能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。
慢病毒感染细胞后如何筛选稳转细胞株
使细胞由荧光显色并且增殖后也有荧光嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始，这个得是稳转株。最好的 *** 是转染表达荧光蛋白的慢病毒嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始，当然前提是你的细胞可以转染慢病毒。你可以自己做，也可以去公司买，不贵。
个人对CRISPR-Cas9筛选的理解嘌呤霉素杀病毒稳转株什么时候开始：CRISPR-Cas9筛选 ：使用阴性筛选，阳性筛选和对照筛选，以文章中使用全基因组gRNA文库筛选使黑色素瘤对细胞毒性T细胞介导的杀伤具有抗性的基因为例。
稳转细胞系常用的 *** 有脂质体转染和慢病毒转染进行稳定株筛选，脂质体法筛单克隆时间耗时长，假阳性高，且效率低，大概只有1%。病毒转染得到稳定细胞株的效率高，只是步骤繁琐。
构建 *** ：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的 *** ，由单细胞增殖形成的细胞群。
顺转的话，我们实验室采用lipo2000，具体步骤百度文库有，英文的protocol在lipo2000的说明书上也能看到。稳转的话一般需要在质粒上构建某个抗性基因，如嘌呤霉素抗性。