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内容导航：1、菌种的传代与保存：标准菌种传代开启微生物质控新篇章2、菌种的传代与保存，常用菌种的传代与保存方法1、菌种的传代与保存：标准菌种传代开启微生物质控新篇章
中吴网讯 微生物领域的质量控制由于自身的复杂性局和限性，相对传统理化项目而言，操作不便，结果判定困难。市排水处监测站在微生物领域的质量控制也一直处于空白。在目前疫情的影响下，开展微生物领域的质控对于提高微生物项目测定的准确可靠性更显得尤为重要。
8月起，监测站质量监督室接手微生物检测项目。通过查找文献，同其他检测机构交流沟通，决定从标准菌种传代着手，同步开展培养基验收工作，由这两方面推动建立符合监测站实际情况的微生物领域质控体系。菌种是从事微生物检测工作的基本材料，而培养基是微生物培养和开展检测的重要药剂，通过培养基进行标准菌种传代直接决定微生物项目检测的质量。
首先，质控室建立了《标准菌种传代作业指导书》、《标准菌种管理规程》，通过这些指导文件的建立，使标准菌种传代和培养基质控有章可依，有据可循。其次开展枯草杆菌和大肠杆菌这两个标准菌种的传代工作。菌种传代的实验操作过程繁琐复杂，具有挑战性，每个菌种一般进行3次传代，为防止菌种突变，最多传到5代。传代工作第一步是对0代菌种进行菌种冻干管的复活，溶解打管，得到1代标准菌种悬液，用于复活增值。第二步，挑选1代菌悬液进行营养琼脂平板划线，将用于复活的1代菌种悬液的试管和平板放入生化培养箱37℃静置培养3天，得到1代复活菌种。同时对1代菌种平板菌落生长情况进行记录观察，并挑取菌落进行革兰氏染色后在显微镜下进行进一步观察菌落形态。第三步，重复1代菌种的实验操作步骤，培养并观察，直至培养出3代菌种。最后3代菌种移至标准菌种保存管，放入-20℃冰箱中保存。至此标准菌种的传代工作全部完成。最后，将冷冻的3代菌种复苏，得到4代菌种，进行培养基的验收工作。
标准菌种传代和培养基验收工作的顺利完成，结果满意，表明监测站微生物领域检测数据是准确、可靠的。同时也意味着监测站在微生物领域质量控制工作有了新的突破。质控人员对微生物领域的专业知识有了新的认知，质控水平得到了提升，为下一步深入开展微生物领域检测工作的质量控制打下了良好的基础。（徐露）
2、菌种的传代与保存，常用菌种的传代与保存方法
一、菌株概念及传代
（1）标准菌株：直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株。通常默认为第0代菌株。
（2）标准储备菌株：将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株。通常为第1代或第2代菌株。
（3）储备菌株：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。通常为第2代或第3代菌株。
（4）工作菌株：由标准储备菌株、 储备菌株或标准物质（经证明或未经证明） 转接一代获得的菌株。通常为第3-5代菌。
传代：每一次的转接培养都是一次传代的过程，可以使用液体、固体或半固体培养基。
注意事项：菌株传代只能由上往下传，储备菌株可以做为工作菌株使用，但工作菌株不能做为储备菌株使用。实验室使用的工作菌株一般不可超过第5代，除非标准方法中有明确要求，或实验室能够证明菌株相关特性没有改变。若在传代过程中出现明显变异，也不可继续使用。
二、菌种保存的基本原理
使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低范围内。干燥、低温和隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。有针对性地创造干燥、低温和隔绝空气的外界条件，就是微生物菌种保藏的基本技术。
三、菌种保存的常用方法 （1）斜面保存法 操作方法：将营养琼脂（或其他适宜的琼脂培养基）加热煮沸溶解后分装至试管中，灭菌后摆长斜面凝固，挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面，置于合适的条件中进行培养。培养结束后，置2-8℃冷藏保存（部分菌株会在4℃产生自溶，如铜绿假单胞菌。副溶血性弧菌等，可置室温保存）。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，操作简单，使用方便，但易变异，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。霉菌、酵母菌、放线菌和芽孢菌一般保存2-4个月传代一次，细菌一般保存一个月传代一次。
斜面保存法
（2）液体石蜡保存法 操作方法：将营养琼脂（或其他适宜的琼脂培养基）加热煮沸溶解，分装至试管中灭菌后摆长斜面，或使用半固体培养基加热煮沸溶解后分装至小试管，灭菌后摆直立，挑取菌落“之”字形划线接种至培养基斜面或穿刺接种至半固体培养基管，置于合适的条件中进行培养。培养结束后，在培养基表面覆盖一层无菌液体石蜡，2-8℃冷藏保存。 液体石蜡一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。此法比斜面保存法的保存期限更长，霉菌、酵母菌、放线菌、芽孢菌可保存1-2年甚至更长时间，多数无芽孢菌也可保存到一年以上。（3）甘油冻存保存法 操作方法：挑取菌落至液体菌种保存管中（商品化的液体菌种保存管中已加入甘油，直接使用即可；若自行配制，可在冻存液中加入15%-50%比例的甘油，或将菌液与无菌甘油溶液混合），用移液枪吹打均匀，制成约109CFU/mL的菌悬液，置于超低温冰箱中或液氮罐中冷冻保存（霉菌可挑取孢子冻存，保存温度越低效果越好，长期保存建议在-70℃以下冻存）。 该方法适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。-20℃保存时间较短，一般可保存一年左右，-70℃以下可保存较长时间，一般至少可保存两年以上，有些菌种甚至可保存十年以上。注意事项：反复冻融易导致菌株死亡，在中国药典中规定，融化后的菌种保存管不可再进行冷冻保存。
液体菌种保存管（含甘油）
（4）真空冷冻干燥保存法 通常以牛奶为载体，加入菌株制成菌悬液，使用真空冻干机器进行脱水冻干处理，制成冻干粉。相比较于其他保存方法，真空冷冻保存法更容易保存菌种的活力，延长保存时间，适用于98%以上菌种的保存，但操作复杂，一般实验室难以使用。 （5）载体保存法 以沙土、滤纸、硅胶等材料做为载体吸附菌株，通过五氧化二磷干燥保藏的方法。保藏时间长，应用较为广泛，但一般实验室通常不易操作。 （6）瓷珠保存法 瓷珠菌种保存管是实验室保存菌种的容器，管内有表面凹孔小瓷珠用于细菌的吸附和保存，甘油做为抗冻保护剂可减少冷冻过程中形成的冰晶，瓷珠菌种保存管放置于-20℃或-80℃下便可创造干燥、低温、缺营养的环境，使菌株处于“休眠” 状态，方可长期保存（视不同菌种与保存温度，一般可保存3-10 年），同时菌种保存管的取用和保存较为便利（取用复苏及保存菌株仅需1 分钟）。 保存方法：挑取平板或斜面上的新鲜纯培养物于菌种保存管中，配成大约3-4麦氏比浊度的菌悬液，盖上盖子来回颠倒几次使细菌乳化，用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，仅留下瓷珠，拧紧保存管，迅速将其置于-20℃或-70℃冰箱中。 使用方法：无菌条件下，用灭过菌的针或者镊子取出一个小瓷珠，将小瓷珠直接用作平板划线或加到合适的液体培养基中，置合适的条件下进行培养即可。
瓷珠菌种保存管
四、实验室常用菌种的保存方法
（1）短期、中期保存：葡萄球菌、沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、假单胞菌、李斯特氏菌等，可使用营养琼脂斜面或TSA斜面4℃保存（铜绿假单胞菌在4℃会出现自溶，可以置室温保存），通常可保存1-3个月。白色念珠菌、酵母菌、霉菌等可使用沙氏葡萄糖琼脂斜面4℃保存，通常可保存3-6个月。生孢梭菌、产气荚膜梭菌可使用疱肉培养基培养后置4℃保存，可存活数月至1年以上。 （2）长期保存：对于大多数的细菌、真菌，普通实验室都可以选用瓷珠保存法或甘油保存法置-20℃以下或-70℃以下冻存，温度越低保存时间越长。（注：保存霉菌时挑取孢子冻存即可；保存厌氧菌建议使用甘油保存法，避免反复冻融；使用甘油冻存法保存弯曲杆菌、螺杆菌、嗜血杆菌等细菌时，加入5%-10%比例的脱纤维羊血效果更佳）。
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